총 평판 계수법을 이용한 미생물 생균수 측정 및 생균수 계산법

총 평판계수법: 미생물 생균수 측정의 기본 원리와 실험 가이드

미생물 생균수를 측정하는 것은 식품, 의약품, 환경 및 다양한 산업 분야에서 매우 중요한 작업 중 하나입니다. 생균수는 미생물의 증식 가능성을 나타내는 값으로, 총 평판계수법은 이를 측정하는 방법으로 오래전부터 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 이번 글에서 총 평판계수법의 개념, 필요성, 구체적인 절차, 주의 사항 및 장단점을 설명해 드리겠습니다.

 

1. 총 평판계수법이란?

총 평판계수법(Total Plate Count Method)은 생균수(CFU, Colony Forming Unit)를 측정하기 위해, 미생물을 영양분이 포함된 고체 배지에 배양한 뒤 생기는 콜로니(집락)를 육안으로 세는 방법입니다. 이 방법은 미생물이 환경에서 얼마나 많이 살아 있고 증식 가능한지를 객관적으로 평가하는 데 사용됩니다.

(1) CFU란 무엇인가?

• CFU(Colony Forming Unit)는 미생물 개체 수를 나타내는 단위로, 한 개의 CFU는 배양 후 콜로니로 확인 가능 합니다..
• 이 값은 살아 있는 세포만 측정하며, 죽은 세포나 비활성화된 세포는 제외할 수 있습니다.

(2) 총 평판계수법의 목적

• 품질 관리: 식품, 음료, 제약 제품의 미생물 오염도를 확인 가능 합니다.
• 안전성 평가: 특정 제품이나 환경이 건강에 해로운 미생물로 오염되었는지 확인 가능 합니다.
• 효능 측정: 살균제, 소독제 또는 방부제의 효과를 시험할 수 있습니다.

 

2. 총 평판계수법의 종류

총 평판계수법은 미생물을 배양하는 방법에 따라 부배양법(Pour Plate Method)과 평판도말법(Spread Plate Method)으로 나눌 수 있습니다. 두 방법은 각각의 장단점과 용도에 따라 달라질 수 있습니다.

(1) 부배양법 (Pour Plate Method)

부배양법은 샘플을 멸균 액체 배지와 혼합한 뒤, 이를 평판 위에 부어 굳히는 방법입니다. 이 방식은 샘플 속 미생물이 고체 배지의 내부와 표면에서 동시에 자라도록 합니다.

장점

• 샘플 속 미생물이 배지 내부와 표면에서 모두 자라므로, 넓은 범위의 미생물 수를 측정할 수 있습니다.
• 상대적으로 샘플 처리량이 많아, 대량 샘플에서 유용한 방법 입니다.

단점

• 배지 내부에서 자란 콜로니는 크기가 작고 불규칙적일 수 있어, 세는 데 어려움이 있을 수 있습니다.
• 열에 민감한 미생물은 뜨거운 배지와의 접촉으로 손상될 가능성이 높습니다.

 

(2) 평판도말법 (Spread Plate Method)

평판도말법은 샘플을 고체 배지 표면에 도말(Spread)하여 미생물이 배지 표면에서만 자라도록 하는 방법입니다. 이 방식은 주로 샘플 속 미생물 수가 적거나 배양 후 콜로니를 개별적으로 관찰해야 할 때 사용 되는 방법입니다.

장점

• 콜로니가 배지 표면에서만 자라므로, 세포 수 계산이 용이합니다.
• 미생물의 형태, 크기, 색깔 등 추가 정보를 쉽게 확인할 수 있습니다.

단점

• 샘플 속 미생물 농도가 너무 높으면 콜로니가 겹쳐져 정확한 계수가 어렵습니다.
• 도말 과정에서 오염 위험이 높습니다.

 

3. 실험 준비 및 재료

(1) 필요한 재료

1. 고체 배지(Agar Media)
   • 영양 한천 배지(Nutrient Agar): 일반 세균 배양용.
   • 특정 배지(Selective Media): 특정 미생물만 선택적으로 배양.
2. 샘플 희석용 용액
   • 멸균 생리식염수 또는 멸균된 증류수.
3. 평판(Petri Dish)
   • 멸균 상태로 준비.
4. 멸균 피펫 또는 마이크로피펫
   • 샘플을 정확히 측정.
5. 도말봉(Spreader)
   • 샘플을 평판 위에 고르게 펴는 데 사용.
6. 멸균기(Autoclave)
   • 배지 및 도구를 멸균.
7. 배양기(Incubator)
   • 일정한 온도에서 미생물을 배양.

 

(2) 실험 전 준비 사항

1. 실험실과 장비를 철저히 소독하여 오염을 미연에 방지합니다.
2. 샘플을 적절히 희석하여 미생물 농도를 조절합니다. 너무 높은 농도는 정확한 계수를 방해할 수 있습니다.
3. 사용 전 배지와 도구가 멸균 상태로 만드는 것은 필수입니다.

 

4. 실험 절차

(1) 부배양법 (Pour Plate Method)

1. 멸균된 평판에 1mL의 샘플(희석된 샘플 포함)을 넣습니다.
2. 약 45~50°C로 식힌 액체 배지를 샘플과 함께 평판에 부어줍니다.
3. 배지를 굳힌 후, 평판을 뒤집어 배양기에 넣고 배양합니다.
4. 배양 후, 평판 위의 콜로니 수를 세어 생균수를 계산합니다.

 

(2) 평판도말법 (Spread Plate Method)

1. 고체 배지로 굳힌 평판 위에 0.1~0.5mL의 샘플을 떨어뜨립니다.
2. 멸균된 도말봉으로 샘플을 배지 표면에 고르게 펴줍니다.
3. 평판을 뒤집어 배양기에 넣고 배양합니다.
4. 배양 후, 콜로니 수를 세어 생균수를 계산합니다.
5.  

 

5. 생균수 계산법

생균수는 아래 공식으로 계산됩니다:

 

생균수 (CFU/mL)=콜로니 수 (CFU) 샘플 부피 (mL) × 희석 배율\text {생균수 (CFU/mL)} = \frac {\text {콜로니 수 (CFU)}}{\text {샘플 부피 (mL) × 희석 배율}}생균수 (CFU/mL)=샘플 부피 (mL) × 희석 배율콜로니 수 (CFU)​

예시

10배 희석된 샘플 1mL를 배양한 결과, 100개의 콜로니가 관찰되었을 경우.

• 생균수 = 1001 ×10−1=1,000 CFU/mL\frac {100}{1 \times 10^{-1}} = 1,000 \, \text{CFU/mL}1×10−1100​=1,000CFU/mL

 

6. 총 평판계수법의 장점과 단점

장점

• 신뢰성: 살아 있는 미생물만 측정 가능.
• 다목적성: 다양한 샘플에 적용 가능.
• 추가 정보: 미생물의 크기, 모양, 색 등을 육안으로 관찰 가능.

단점

• 시간 소요: 배양에 1~3일 소요.
• 숙련도 요구: 희석과 도말 과정에서 실수가 발생할 수 있음.
• 오염 가능성: 실험 환경에 민감.

 

7. 주의 사항 및 팁

1. 적절한 희석: 높은 농도의 샘플은 희석하여 정확한 계수가 가능하도록 합니다.
2. 멸균 관리: 모든 실험 도구와 환경을 철저히 멸균하여 외부 오염을 방지합니다.
3. 콜로니 겹침 방지: 적정 농도의 샘플을 사용하여 콜로니가 겹치지 않게 합니다.
4. 배양 조건: 미생물의 최적 성장 온도(보통 35~37°C)를 유지합니다.

 

8. 응용 사례

(1) 식품 산업

• 우유, 음료, 육류 등에서 미생물 오염도를 확인하여 품질을 관리합니다.

(2) 제약 산업

• 의약품의 미생물 오염 여부를 검사하여 안전성을 확보합니다.

(3) 환경 분석

• 수질 검사, 토양 분석 등 환경 중 미생물 분포를 파악합니다.

 

결론

총 평판계수법은 미생물 생균수를 측정하는 기본적이고 신뢰성 높은 방법입니다. 부배양법과 평판도말법은 각각의 특성과 용도에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있습니다. 실험 환경의 철저한 관리와 적절한 절차를 따르면, 총 평판계수법은 식품, 의약품, 환경 등 다양한 분야에서 미생물 분석의 강력한 도구가 될 것입니다.